Федеральное государственное бюджетное научное учреждение

"Всероссийский научно-исследовательский институт пресноводного рыбного хозяйствa"

Многоканальный телефон с 9:00 до 18:00
+7 (495) 108-68-56 

 

Вы здесь

Формирование низкотемпературного генного банка спермы рыб (состояние, развитие, перспективы)

 

Криобанк   

      Острейшей проблемой природы, в том числе и современного рыбоводства, является сохранение генетического разнообразия рыб. Эта проблема важна как для редких и исчезающих видов, так и для объектов аквакультуры. Достигнутые успехи в консервации спермы рыб, позволяют подойти к решению проблемы создания в рыбоводстве банков криоконсервированной спермы, как этто широко практикуется в животноводстве. Создание промышленных банков даст возможность поставить селекционно-племенную работу на качественно новый уровень. Сохраняемый в низкотемпературных банках генетический материал может быть использован в селекционных работах при выведении новых пород, для сохранения стандарта породы, получения гибридов, в том числе гибридов рыб, имеющих разные сроки созревания половых продуктов, для получения потомства при отсутствии или недостатке зрелых самцов, а также для обмена замороженной спермой между рыборазводными заводами. Наличие банков криоконсервированной спермы позволитселекционеру оперировать со значительно большим разнообразием генетического материала, обеспечивая тем самым более широкие возможности для синтетической селекции. Большие перспективы предоставляются и для работ по промышленной гибридизации, выявлению наиболее эффективных гетерозисных комбинаций и их быстрейшему внедрению. При этом обеспечение  спермой для проведения селекционных работ и промышленной гибридизации может осуществляться централизованно из ограниченного числа низкотемпературных банков.

    Основной задачей иследований по низкотемпературной консервации половых продуктов является усовершенствование базовых и разработка новых эффективных методов криоконсервации спермы рыб с целью сохранения генетического разнообразия редких, исчезающих рыб и промышленного получения жизнестойкого потомства объектов промысла и аквакультуры, создание банка криоконсервированной спермы, осуществление сбора коллекции спермы генетически ценных видов рыб, а также разработка способов реализации сохраненной в криобанке генетической информации с использованием достижений молекулярной биологии и биологии развития.

    На протяжении ряда лет на рыбоводных базах ВНИИПРХ проводилось выращивание карпа и осетров, полученных с использованием замороженной спермы. Оказалось, что потомства карпа, полученные с использованием криоконсервированной спермы, имели некоторые преимущества (массонакопление, выживаемость, плодовитость) по сравнению с полученными традиционным методом. Анализ гематологических (концентрация гемоглобина, белка, количество эритроцитов) и биохимических показателей мышц указывает на хорошее физиологическое состояние рыб. Аналогичные результаты получены и при выращивании осетров от личинки до восьмигодовалого возраста на Конаковском живорыбном заводе. Проведение серии опытов по выращиванию молоди карпа по специально разработанной программе с использованием общего контроля на протяжении ряда лет показало преимущества потомков, полученных с помощью криоконсервированной спермы, по устойчивости к неблагоприятным условиям (соленость воды от 1 до 5%, температура воды 12-13ºС и 35-37ºС, острая и хроническая гипоксия, воздействие гексахлорциклогексана) по сравнению с контролем (Цветкова и др., 2001а).

     В результате многочисленных экспериментов установлено, что криоустойчивость сперматозоидов в значительной степени зависит от условий содержания производителей. Нарушения кислородного и температурного режимов, кормления, передержки и пересадки производителей карповых и осетровых рыб приводят к неспособности спермиев переносить процедуры замораживания-оттаивания даже при использовании эффективных криозащитных сред. Отмечено, что сперма севрюги, стерляди, веслоноса, сазана, обитающих в естественных водоемах, более криоустойчива, чем у этих же видов рыб, выращенных в искусственных условиях. В связи с этим вопрос сертификации и стандартизации образцов замороженной спермы, хранящихся в криобанках, может быть решен только после стандартизации и соблюдении всех рыбоводных норм выращивания и содержания производителей.

     Успех криоконсервации спермы определяется одновременным действием множества факторов: качеством нативной спермы, которое в значительной степени зависит от условий содержания производителей, качеством и количеством веществ, входящих в состав применяемой криозащитной среды, подбором видоспецифичных криопротекторов, режимом замораживания и оттаивания. В результате исследования влияния этих факторов были разработаны криопротективные среды и практические приемы консервации спермы лососевых, карповых и осетровых рыб, обеспечивающие сохранение жизнеспособности до 70-90% сперматозоидов, которые изложены в технологии криоконсервации и хранения в низкотемпературном банке спермы рыб.

     Были испытаны  криозащитные среды со сложными и простыми солевыми добавками. Оплодотворяющая способность спермиев сохранялась как при замораживании в средах с большим количеством солей, так и с малым. Добавление в среды спермосана, глицина, простагландинов, фитогормона, АТФ, резорцина, формамида, вытяжки из слизи стрессоустойчивых рыб показало повышение криоустойчивости сперматозоидов при использовании АТФ, спермосана, фитогормона эпибрассинолида. Остальные добавки не дали значимого эффекта, так же, как и антиоксиданты токоферол и тонарол, использованные при криоконсервации спермы карпа.

     Нами совместно с сотрудниками Института биофизики клетки РАН исследована возможность крипротективного влияния антифризных гликопротеинов (АФГП), выделенных из сыворотки крови атлантической трески и камбалы, мучногохрущака, гаммаруса, обеспечивающих их выживание после зимних минусовых температур, на криоустойчивость спермы радужной форели, стальноголового лосося, карпа, осетров. При использовании АФГП в криозащитных средах значительно снижаются внутриклеточные повреждения, повышается выживаемость и оплодотворяющая способность спермиев после дефростации.

     В результате криоконсервирования в клетках могут возникнуть криоповреждения, причинами которых является образование в цитоплазме кристаллов льда, разрушающих внутриклеточные структуры. В процессе криоконсервации важно обнаружение летальных и нелетальных повреждений которые возникают в клетке как на этапах перехода в состояние глубокого холодового анабиоза, так и последующем возврате к условиям нормотермии, при которых часть клеток обладает способностью репарировать эти повреждения.

     Если среда оказывается токсичной для клеток или организмов, в них начинаются патологические процессы той или иной степени тяжести. При повреждении клеток, вызванных различными причинами, развивается неспецифический "окислительный стресс", включающий развитие цепных реакцийперекисного окисления липидов, образование супероксид-радикалов, повреждающих мембранные структуры клетки, а также генетический материал, а на более поздних стадиях изменение (как правило снижение) активности мембранно-связанных ферментов, а также ферментов антиокислительной защитной системы клетки. Для определения уровня криптоповреждений сперматозоидов рыб нами разработан способ, ориентированный на метаболический критерий - интенсивность свободно-радикальных реакций. Способ позволяет определить криоповреждения перед закладкой проб на долгосрочное хранение в криобанк и способствует сокращению объема коллекции за счет выбраковки образцов низкого качества и расходов на обслуживание биохранилищ.

     С использованием разработанных методов создана единственная в Российской Федерации генетическая коллекция спермы и тканей, представленная почти 2000 образцами спермы более 50 видов и популяций карповых, сиговых, осетровых и лососевых рыб. Общий объем спермы, хранящейся в криобанке, составляет около 20 л. Для формирования коллекции отбираются образцы спермы и тканей, относящиеся к различным категориям селекционных достижений, в том числе внесенных в Государственные реестры, экспериментальных линий, а также редких и исчезающих видов и популяций, внесенных в Красные книги России или региона, в списки видов, нуждающихся в особом режиме охраны.

     Криобанк работает в экспериментальном режиме. Замороженная сперма используется в основном для специальных селекционных, биохимических и генетических исследований. проверка спермиев некоторых видов рыб, заложенных на хранение в криобанк в разные годы, показала в целом высокую сохранность клеток в исследованных образцах. Было установлено, что длительность хранения не снижает оплодотворяющую способность криоконсервированных сперматозоидов.

     ВНИИПРХ приступил к выполнению принципиально нового направления исследований - разработке способов реализации сохраненной в спермиях генетической информации с использованием методов молекулярной биологии и биологии развития. Начато изучение возможного сочетания методов диспермного андрогенеза и криоконсервации спермы для восстановления редких и исчезающих видов рыб. Комбинированное использование этих методов является альтернативным замораживанию эмбрионов подходом к сохранению биоразнообразия рыб. данный подход позволяет получать потомство с исходным уровнем генетической изменчивости даже, в том случае, если восстанавливаемый вид полностью вымер, а сохранилась только его криоконсервированная сперма. В предварительно проведенных опытах от некоторых видов осетровых рыб были получены жизнестойкие андрогенетические потомства.

     Сохранение генофонда различных видов рыб и их генетического разнообразия в настоящее время возможно с использованием в качестве генетического материала банков спермы и яйцеклеток близкородственных видов.

 


ЗАКЛЮЧЕНИЕ    

     Таким образом, разработанные криотехнологии позволят создать страховые запасы спермы исчезающих и генетически ценных видов рыб. Важным и существенным способом реализации результатов является минимизация затрат на сохранение генофонда редких и исчезающих видов рыб.

     Сохраняемый генетический материал может широко использоваться в селекционной работе: в породообразовании - криоконсервированная сперма генетически ценных самцов, которые погибли несколько лет назад; для получения жизнестойкого потомства; для гибридизации рыб при отсутствии самцов; в разработках по оптимизации технологии криоконсервации; для восстановления генотипов исчезающих видов рыб с использованием метода индуцированного андрогенеза.

 


    

Работа в криобанке   Хранящиеся образцы   Работа в криобанке

Работа в криобанке   Работа в криобанке

 

 

 


Автор: Л.И. Цветкова, Н.Д. Пронина, О.Б. Докина, А.В. Рекубратский, В.А. Парнышков

Источник: Вопросы рыболовства, 2012, том 13, №3 (51), с. 538-545

Фото: информационно-аналитический отдел